PrecisionMed_MassARRAY个人技术剖析
PrecisionMed_MassARRAY个人技术剖析
上篇文章对MassARRAY平台系统的前世今生、技术原理、技术特点和应用领域作了详细的介绍，此篇文章将会针对MassARRAY平台的技术原理进行深入的解刨和分析，以期让每个爱好基因检测的人都能看懂。
想要搭建一个完整而独立的，至少应该包括MassARRAY点样仪（RS1000）、MassARRAY飞行质谱仪（MALDI-TOF）及MassARRAY配用软件电脑，三者缺一不可。对应的配套耗材和试剂有芯片（有384及96之分）和树脂、PCR扩增试剂盒、SAP和UEP试剂盒和一盒Taq酶，五者缺一不可。MassARRAY仪器价格分别为96孔25万$（半自动，且正在申报CFDA认证，预计最快明年可以拿到证）/384孔30万$（包括上述三者仪器），每套耗材和试剂6万RMB（包含上述五者耗材和试剂）。（如下图所示）
MassARRAY的整个技术流程大致分为：DNA制备-PCR扩增-SAP消化-UEP延伸-树脂纯化-点样-质谱检测。24/96-well format:~6 1/2hr from start to finish ;384-well format:~7 hr from start to finish（前提是使用Veriti-384 PCR，不能使用ABI 9700-384 PCR，Veriti-384 PCR比ABI 9700-384 PCR速率快，而且边缘效应更好，但是没有ABI 9700-384 PCR的通量高）。（如下图所示）
个人技术剖析1：首先，针对于A/G两个不同的SNP进行检测，我们需要设计两对PCR引物，并且上下游的引物两端需要加上10 mer tag （ACGTTGGATG），这个主要的目的是为了使PCR引物》30bp（后面SAP没有完全消化掉PCR引物，它也不会出现在最后的质谱图上，质谱图峰检测的范围是4500Da~9000Da之间，ATCG的分子质量约为300Da，那么对应检测的范围是15~30bp之间）。（如下图所示）
然后，通过PCR引物扩增后，可以进行目的片段的富集。（如下图所示）
再者，PCR扩增后，我们需要进行SAP消化，去除多余的酶、buffer、mg2+、dNTP等试剂。（如下图所示）
杂交延伸扩增。（如下图所示）
最后，进行单碱基延伸扩增（以A/T/C/G终止）。（如下图所示）
最后我们通过质谱检测单碱基的峰图便可以直观的读出结果。
个人技术剖析2：理论上，在没有延伸产物的时候，是只有UEP峰图的，这种情况下UEP是独峰（一般做UEP Primer Check的时候可常见）。（如下图所示）
如果一旦有目的SNP片段出现，UEP峰则会消失，出现后面延伸的单碱基峰图，比如下图的A。
如果目的SNP片段是杂合，UEP峰不仅会消失，后面出现延伸的单碱基峰图，则为A/G两条峰图，比如下图的A/G。
个人技术剖析3：下图为质谱仪上的操作流程，主要是通过激光激打芯片上的基质，最后根据ATCG四种碱基质量/电荷的飞行时间来读取结果。
产物和带有基质的芯片共价结晶后，在激光的激发下（激光解析电离），全部带正电，这样ATCG飞行的时间只跟它们的质量有关系。
激光激发后，相应的离子则会在电场里进行飞行，质量大的飞行的速度慢（蓝色点），质量小的飞行的速度快（红色点），相应的质谱上显示的峰图则为红色高，蓝色低，根据飞行的时间则可进行相应的结果解读。
这是个非常完美的质谱峰图
个人技术剖析4：DNA主要包括，四个碱基的不同排列组合构成了遗传的密码信息。MassARRAY的主要核心就是根据A、T、C、G四个碱基的不同分子质量进行检测的，dAMP = 313.2 Da/dCMP = 289.2 Da/dGMP = 329.2 Da/dTMP = 304.2 Da，对应的关系如下图所示：
由上图可以看出其实没有经过修饰的A、T、C、G四个碱基的质量区分不是很明显，AC=24Da/AG=16Da/AT=9Da/CG=40Da/CT=25Da/TG=25Da，为了彰显MassARRAY技术的优势，最早的Sequenom公司对A、T、C、G四个碱基的ddNTP进行了修饰（这是试剂最贵重的部分，决定处理样本数量最终是看ddNTP而不是看酶的多少，这跟市场大部分公司相悖），修饰后的结果如下图所示：
由上图可以看出经过修饰的A、T、C、G四个碱基的质量有明显的不同，区分起来也很明显，AC=24Da/AG=16Da/AT=56Da/CG=40Da/CT=80Da/TG=40Da，这也是单碱基延伸技术的关键核心所在。
个人技术剖析5：扩增取决于提供的能量三磷酸核苷酸组。
SAP消化核苷酸的磷酸基，所以剩下的核苷酸可以不再从事扩增。
SAP反应后，核苷酸的活动都被删除了，在反应延伸的时候，ddNTPs添加所以只允许单碱基扩增。
个人技术剖析6：矩阵垫直径大约是200微米，激光大约是直径75微米，收集数据必须从多个位置进行采集，更多的位图意味着更多的数据意味着更高的精度。一般激光激打芯片上的点会取9个好点的位置反复激打20次，然后选取5个比较好的值进行平均分析，算出其CV%值。
个人技术剖析7：之前的UEP延伸部分，为下图所示：大约进行了100次循环。
后来经过完善可以达到200次循环，大大增加了产物的浓度（增加了5个内循环）。
个人技术剖析8：寡核苷酸的不同的长度有不同的解吸特性（MALDI-TOF-MS），长的寡核苷酸观察到较低强度，iPlex理想需要相同的强度，整个WELL的引物有几种不同的方法来调整引物。（出现该种情况的原因一般有两个，一个是市场上的引物合成公司，合成引物的时候出现的OD量不准，另一个是人为设计的时候强行将SNP加进去，形成了引物内部之间的竞争导致的结果）
引物可通过观察到的强度质量有关的线性方程式来进行调整，记得以前工作的时候都是用Prism 5.0来计算线性回归的。
通过一般的基线值可以很明显的看出差异：一般可以通过线性回归计算出结果再补Mix的量，保持着峰低多补Mix的原则即可。
24 plex Extend primer mix (Equimolar)
24 plex Extend primer mix equilibrated using the regression method
该篇文章的技术性较强，需要慢慢的消化，后续的文章我会介绍MassARRAY实验的流程及需要注意的细节，敬请关注！